Главная / Наука о пчелах / Анализ фрагментов ДНК

Новое программное обеспечение для сравнительного анализа набора фрагментов ДНК

Одним из перспективных подходов к изучению геномов растений и животных является использование в качестве молекулярных маркеров полиморфных последовательностей ДНК. Такие последовательности рассеяны по всему геному и для определения их полиморфизма применяют различные методы полимеразной цепной реакции (ПЦР) с произвольными и специфическими праймерами. Одним из наиболее активно применяемых методов изучения полиморфизма ДНК является метод случайной амплификации полиморфных последовательностей ДНК (random amplified polymorphic DNA – RAPD) или амплификации ДНК со случайным праймером [Welsh J., McClelland M. Nucl. Acids Res., 1990; Williams J.G.K. et al., Nucl. Acids Res., 1990].

Метод основан на использовании в ПЦР коротких (10-20 пар нуклеотидов) синтетических или природных праймеров со случайной последовательностью нуклеотидов. Чаще всего используется единичный праймер, хотя некоторые исследователи одновременно используют несколько [Матвеева Т.В. и др. Сб. тезисов 9-й Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых, 2005; Мязин А.Е. Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук, Москва, 2006].

Праймер связывается с ДНК в двух различных участках инвертированных повторяющихся последовательностях (содержащих сайт посадки такого праймера), и расположенных в геноме достаточно близко друг от друга, на расстоянии, допускающем эффективное прохождение ПЦР. Количество мест посадки случайного праймера может колебатся от нескольких сотен до нескольких десятков тысяч. В результате проведения такой ПЦР получается набор амплифицированных фрагментов, сканирующий весь геном в целом (рис 1). При электрофоретическом разделении продуктов амплификации образуется набор дискретных полос разной длины и интенсивности, или, другими словами, набор ДНК-паттернов. ДНК, выявляемая с помощью этого метода, функционально неоднородна и представляет собой фрагменты специфических локусов, повторы, мобильные элементы и другие типы последовательностей, которые встречаются в геноме от нескольких сотен до нескольких тысяч раз.[Laayouni H., Santos M., Fontdevila A. Genetics. 2000].

Различия в ДНК-паттернах определяются различиями в одном или обоих праймер-связывающих сайтах (наличие или отсутствие полосы ПЦР-продукта в спектре) или присутствием инсерции/делеции в амплифицируемом фрагменте (различия ПЦР-продуктов по размеру).

RAPD-анализ может служить своеобразным экспресс-методом выявления генетического полиморфизма, без необходимости секвенирования изучаемых последовательностей. К тому же он позволяет проводить массовый скрининг образцов, поскольку не требует специального оборудования, материалов, относительно дешев и прост в освоении. Диагностические возможности разнообразных методов ПЦР и, в частности метода РАПД, успешно проиллюстрированы на многочисленных примерах описания генетического разнообразия микроорганизмов, высших растений, беспозвоночных и позвоночных животных.

С помощью этих методов возможно осуществить:

  • определение генетического полиморфизма и филогенетических связей у представителей различных родов растений и животных (Морозова Е.И. и др. Генетика, 2002; Гундерина Л.И. и др. Генетика, 2003, 2005; Кузнецова О.И. и др. Генетика, 2005; Ковеза О.В. и др. Генетика, 2005];
  • анализ динамики генетических процессов в популяциях диких и одомашненных животных и растений и описание структуры вида [Е.З. Кочиева и др. Генетика, 2002];
  • генетический анализ эволюционной дивергенции видов [Е.А. Салменкова и др. Генетика, 2005; Коршиков И.И. и др. Генетика, 2005];
  • изучение индукции полиморфизма ДНК, а следовательно – нестабильности генома у потомков , вызванного воздействием повреждающих агентов на их родителей [Безлепкин В.Г. и др. Доклады Академии Наук, 2000; Радиационная биология. Радиоэкология, 2000];
  • генетическое картирование отдельных видов [Welsh J., McClelland M. Nucl. Acids Res., 1990; Williams J.G.K., et al., Nucl. Acids Res., 1990 ];
  • маркирование хозяйственно-ценных признаков [Иванов М.К. и др. Доклады Академии Наук, 2002] и создание геномодифицированных сортов и пород (R. Waugh and W. Powell Trends in biotechnology, 1992];
  • идентификацию и дифференциацию штаммов, пород и отдельных линий культурных растений, c/х и лабораторных животных [А.Г. Николенко, А.В. Поскряков и др. Генетика, 1998, 2002; Безлепкин В.Г. и др. В сб. Вопросы апидологии и пчеловодства., Ижевск, 2000].

Полиморфизм фрагментов ДНК сложно регистрировать вручную, так как набор таких фрагментов часто велик, что естественно, так как сканируется весь геном, а не отдельные уникальные кодирующие области известных генов. Метод RAPD, в частности, позволяет перейти к массовому скринингу образцов с использованием высоких технологий. Существующие коммерческие программы для анализа изображений такие как, например Win Dig (www.unige.ch/sciences/chifi/cpb/windig.html) или Scion Image созданной Scion Corporation (http//www. Scioncorp.com), находятся в свободном доступе, но не имеют там технической поддержки.

Также разработаны специальные системы гель-документирования и создано программное обеспечение для анализа полученных изображений. Системы гель-документирования способны переносить в компьютер, хранить и обрабатывать изображения гелей, получаемых с помощью трансиллюминатора, теле- или фотокамер. При их использовании значительно облегчается документирование результатов ПЦР. Система гель-документирования позволяет не только получить цифровое изображение геля, но и сохранить его в базу данных с коротким комментарием, а также улучшить качество изображения с помощью прилагаемого программного обеспечения. Примером таких систем могут быть: Gel lmager-2(Россия) и ее программное обеспечение Gel lmager, DOC-PRINT DP-001.FDC ( Vilber Lourmat, Франция) и программное обеспечение Photo Capt MW и, наконец, Integrated Image Analysis Systems Quantity (Bio-Rad, USA) с программным обеспечением One 1-D Analysis Software, а так же многие другие.

Как правило, программное обеспечение выполняет ряд функций: например, позволяет сохранять изображение в различных форматах, наносить на изображение текст и символы, а также редактировать изображения, то есть поворачивать, получать зеркальные и негативные копии, изменять яркость и контрастность. С помощью программного продукта возможна автоматическая идентификация полос и пятен, расчет площади и интенсивности свечения пятен, расчет молекулярной массы при наличии стандартов. Он выполняет сравнение с эталонной пробой, определяет интенсивность свечения; возможна работа в режиме накопления сигнала, позволяющая получать качественное изображение даже очень слабо светящихся объектов. Он позволяет анализировать электрофоретические гели, дот блоты, слот блоты, подсчитывать число колоний. Изображения могут быть радиоактивными, хемилюминесцентными, флюоросцентными или цветными окрашенными колониями.

Однако при массе многообразных функций все эти и многие другие программные продукты не имеют некоторых специфических опций, которыми обладает представляемый нами программный продукт «Сравнительный анализ гелей» или GelAnalyser.
В рамках выполнения проектов по исследованию эффектов гамма-радиации, проявляющихся у потомков облученных родителей, разработано программное средство для распознавания и корректного сравнения длин фрагментов ДНК, включающих до 100 дискретных полос на дорожках при электрофоретичеком разделении продуктов ПЦР. Программа “Сравнительный анализ гелей” создана на основе ранее разработанной нами утилиты [Скосырев и др., 2005] в среде Delphi (Object Pascal) и работает под управлением Windows. В отличие от предыдущих разработок [Сирота Н.П. и др. Генетика, 2000] последняя версия программы является самодостаточной и не требует наличия сопроводительного программного обеспечения WinDig 2.5 (www.unige.ch/sciences/chifi/cpb/windig.html) как это было необходимо раньше.

GelAnalyser отличается двумя важными особенностями, а именно:

  • во-первых, в течение всего времени работы можно визуально контролировать каждую операцию по всей области анализируемого геля;
  • во-вторых, GelAnalyser позволяет выделять исследуемый диапазон индивидуально на каждой дорожке и присваивает первой и последней полосе диапазона координату «0» и «1», соответственно. Это позволяет не учитывать возможное искривление дорожек или появление «улыбки» при разгоне фрагментов ДНК, которое приводит к разной степени разбегания полос на разных дорожках геля. Взаимное положение полос, а, следовательно, и их координаты друг относительно друга будут одинаковыми, не взирая на степень разгонки.

GelAnalyser осуществляет “оцифровку” графических изображений гелей в формате BMP и JPG, полученных с применением сканера, телекамеры или цифрового фотоаппарата. В нашем случае использовался сканер Epson Perfection 1650 Photo (Seiko Epson Corporation, Japan ) на котором сканировались высушенные гели, после окрашивания азотнокислым серебром [Caetano-Anolles G., Gresshoff P.M. Promega Notes Magazine, 1994]. В процессе идентификации фрагментов можно вручную изменить, добавить или удалить координату идентифицированного GelAnalyser-ом виртуального аналога полосы и в последствии провести сравнительный анализ этих координат на разных дорожках геля. При этом можно изменить допустимую погрешность при проведении сравнительного анализа в достаточно широких пределах.
Возможность работы в “ручном режиме” позволяет не только регистрировать неидентифицированные программой полосы, но и исключать артефактные объекты (загрязнения) на изображениях электрофореграмм, иногда принимаемые GelAnalyser за полосы.

GelAnalyser определяет величины электрофоретической подвижности (Rf) продуктов на дорожках геля. Данный программный продукт осуществляет сравнение спектров электрофоретических полос на сходство и различие составляющих их компонентов на основе определения нормированных координат (значений Rf) с представлением количественных оценок. Существует два варианта возможного сравнения:

  • во-первых, можно сравнить набор фрагментов полученных из ДНК родителей с набором, полученным из ДНК потомков и выявить так называемые «неродительские» фрагменты, то есть отсутствующие у обоих родителей;
  • во-вторых, можно провести сравнительный анализ всех дорожек геля между собой и выявить мономорфные (присутствующие у всех), индивидуальные (характерные для одного) и полиморфные полосы, то есть полосы имеющиеся на нескольких дорожках, но меняющие свое положение на других.

В результате GelAnalyser подсчитывает общее число проанализированных полос, % неродительских, индивидуальных, мономорфных и полиморфных полос, наряду с некоторыми статистическими параметрами (среднее арифметическое, стандартная ошибка и стандартное квадратичное отклонение).

GelAnalyser осуществляет экспорт результатов анализа в текстовые редакторы (например, в таблицы программы Excel) для дальнейшего использования. Максимально упрощенный интерфейс утилиты облегчает ее использование неискушенными пользователями. GelAnalyser не требует специальной процедуры инсталляции и большого объема памяти компьютера. Возможно, что данный программный продукт (или его модификации) найдет эффективное применение не только при анализе RAPD-паттернов, но и в биологических и биомедицинских исследованиях с использованием различных вариантов технологии генотипирования, где также анализируются сложные наборы продуктов амплификации, рестрикции или паттернов гибридизации ДНК и требуется адекватное программное обеспечение.

Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (гранты 03-04-48274 и 06-04-49418), а также Программы Президиума РАН «Фундаментальные науки – медицине» (2005 и 2006 г).

В.С. Скосырев*, М.Г. Ломаева, Г.В. Васильева, В.Г. Безлепкин.
Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, *Филиал Института биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН.

Список литературы:

  1. Безлепкин В.Г, Васильева Г.В., Ломаева М.Г., Сирота Н.П., Газиев А.И. Вариабельность продуктов ПЦР с произвольным праймером на ДНК-матрице потомства мышей-самцов, облученных малыми дозами радиации, Доклады Академии Наук, 2000, т.372, №4, с.558-561.
  2. Безлепкин В.Г, Васильева Г.В., Ломаева М.Г., Сирота Н.П., Газиев А.И. Исследование нестабильности генома методом анализа фингерпринтов ДНК потомства самцов мышей, подвергнутых хроническому гамма-облучению в малых дозах , Радиационная биология. Радиоэкология, 2000, т. 40, с.506-512.
  3. Безлепкин В.Г., Ломаева М.Г., Васильева Г.В. Генотипирование пород пчел методом полимеразной цепной реакции: обоснование исследований и наладочные эксперименты, В сб. Вопросы апидологии и пчеловодства, Ижевск, 2000, с.3-11.
  4. Гундерина Л.И., Кикнадзе И.И., Истомина А.Г., Голыгина В.В. Изменчивость и дивергенция мультилокусных маркеров генома у видов рода Chironomus (Diptera, Chironomidae), Генетика, 2005, т.41, №12, с.1634-1643.
  5. Гундерина Л.И., Салина Е.А. Полиморфизм и дивергенция мультилокусных маркеров ДНК у видов-двойников Chironomus riparius u Chironomus piger Strenzke (Diptera, Chironomidae), Генетика, 2003, т.39. №8, с.1059-1065.
  6. Иванов М.К., Ревенко А.С., Кабилов М.Р., Дымшиц Г.М. RAPD-анализ митохондриальной ДНК сахарной свеклы: использование для поиска генов системы ЦМС, Доклады Академии Наук, 2002, т. 387, № 2, с.279-281.
  7. Ковеза О.В., Кокаева З.Г., Коновалов Ф.А., Гостимский С.А. Выявление и картирование полиморфных RAPD- маркеров генома гороха (Pisum sativum L.) Генетика, 2005, т.41, №3, с.341-348.
  8. Коршиков И.И., Пирко Н.Н., Пирко Я.В. Генетическая изменчивость и дифференциация популяций Abies alba Mill. в украинских Карпатах, Генетика, 2005, т.41, №3, с.356-365.
  9. Кочиева Е.З., Рыжова Н.Н., Храпалова И.А., Пухальский В.А. Определение генетического полиморфизма и филогенетических связей у представителей рода Lycopersicon (Tourn.) Mill. методом маркирования межмикросаттелитных последовательностей, Генетика, 2002, т.38, №8, с.1133-1142.
  10. Кузнецова О.И., Аш О.А., Хартина Г.А., Гостимский С.А. Исследование растений-регенерантов гороха (Pisum sativum L.) с помошью молекулярных RAPD- и ISSR-маркеров Генетика, 2005, т.41, №1, с.71-77.
  11. Матвеева Т.В., Богомаз Д.И., Лутова Л.А. “Сравнительная характеристика методов RAPD и semi-RAPD для молекулярного картирования растительных геномов”. Сб.тезисов 9-й Междунородной Пущинской школы-конференции молодых ученых, 18-22 апреля 2005, с.120.
  12. Морозова Е.И., Рысков А.П., Семенова С.К. RAPD-изменчивость двух видов трематод (Fasciola hepatica u Dicrocoelium denditicum) из популяции крупного рогатого скота Генетика, 2002, т.38, №8, с.1155-1162.
  13. Мязин А.Е. “Молекулярно-генетический анализ полиморфизма ДНК у потомков мышей, подвергшихся острому и хроническому ?-облучению” Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук, Москва, 2006.
  14. Никаноров Ю.М., Беньковская Г.В., Николенко А.Г., Поскряков А.В., Вахитов В.А. Использование метода ПЦР для контроля чистопородности пчелосемей Ahis mellifera mellifera L. в условиях Южного Урала, Генетика, 1998, т.34, №11, с.1574-1577.
  15. Николенко А.Г., Поскряков А.В. Полиморфизм локуса COI-COII митохондриальной ДНК медоносной пчелы Ahis mellifera L. на Южном Урале, Генетика, 2002, т.38, №4, с.458-462.
  16. Салменкова Е.А., Омельченко В.Т., Радченко О.А., Гордеева Н.В., Рубцова Г.А., Романов Н.С. Генетическая дивергенция гольцов рода Salvelinus Кроноцкого озера (полуостров Камчатка), Генетика, 2005, т.41, №8, с.1096-1107.
  17. Скосырев В.С., Васильева Г.В., Ломаева М.Г., Безлепкин В.Г. Утилита для анализа полиморфизма продуктов AP-PCR как маркера нестабильности генома, Материалы Третьего Съезда общества биотехнологов России имени Ю.А. Овчинникова, Москва, 2005, с. 77-78.
  18. Сирота Н.П., Васильева Г.В, Ломаева М.Г. Сирота А.Н., Безлепкин В.Г. Компьютерный анализ вариабельности полос на ДНК-фингерпринтах , Генетика, 2000, т.36. № 4, с. 570-574.
  19. А.В.Хрунин, Н.А.Бебякова, В.П.Иванов, М.А. Солодилова, С.А. Лимборская Полиморфизм микросаттелитов Y-хромосомы в русских популяциях севера и юга России на примере Курской и Архангекльской областей Генетика, 2005, 41, №8, с.1125-1131.
  20. Caetano-Anolles G., Gresshoff P.M. // Promega Notes Magazine. 1994. V. 45. P. 13-18.
  21. Laayouni H., Santos M., Fontdevila A. Toward a physical map of Drosophila buzzatii: Use of randomly amplified polymorphic DNA polymorphisms and sequence-tagged site landmarks, Genetics, 2000, V.165, P.1797-1816.
  22. R. Waugh and W. Powell Using RAPD markers for crop improvement. Trends in biotechnology 1992, v. 10, № 6, p. 186-191.
  23. Welsh J., McClelland M., Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers, Nucl. Acids Res., 1990, V.18, P.7213-7218.
  24. Williams J.G.K., Kubelek .A.R., Livak.K.J. Rafalski I.A., Tongey S.N. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers, Nucl. Acids Res., 1990, V.18, P.6531-6535.