Генотипирование пород пчел цепной реакцией
Обоснование исследований и наладочные эксперименты
Успехи экспериментальных исследований генетики пчел. Медоносная пчела (Apis mellifera) является результатом сложной эволюции трех удаленных ветвей: западной Европейской, северной Средиземноморской и Африканской. Эти три ветви были выделены с помощью морфометрических методов [1], а несколько позже были получены дополнительные факты посредством анализа митохондриальной ДНК [2]. В серии работ [3; 4] подчеркивалось, что именно пчелы являются наиболее подходящим объектом для генетического анализа с использованием метода полимеразной цепной реакции (ПЦР).
Пчелы - "гаплодиплоидные" насекомые. Самки - диплоидны, самцы (дроны)- гаплоидны (результат партеногенетического развития неоплодотворенных яиц). У трутней, таким образом, нет отцов, хотя у них есть деды по материнской линии. В процессе сперматогенеза (по типу характерного для пчел абортивного мейоза) не происходит редукции числа хромосом. Все образующиеся сперматозоиды у дронов являются генетически идентичными (за исключением несущих мутации), и, таким образом, все потомки конкретного дрона наследуют один и тот же геном без вариаций. Такая ситуация действительно наблюдается в случае искусственного осеменения пчелиной "королевы" одним дроном.
При обычном (естественном) способе размножения пчел "королева" осеменяется "облаком" дронов примерно из 12- 17 особей. В случае искусственного осеменения пчеломатки только одним дроном нерепродуктивные диплоидные самки (рабочие пчелы) из одного субсемейства наследуют в среднем 75% генов по материнской линии. Как отмечают Hunt & Page [5]. анализ гаплоидов может быть исключительно полезным для решения двух задач:
- получения детальной информации по гетерозиготным локусам у пчеломатки,
- выяснения характеристичного (для конкретной породы) набора генетических маркеров у диплоидных сибсов, потенциальных пчеломаток.
Выявленные этими авторами четыре типа наследования признаков (на основе анализа полиморфных генетических маркеров, генерированных в ПЦР с произвольным праймером -1111) позволяет надеяться на возможность эффективного использования ПП ПЦР-генерируемого полиморфизма для решения задач не только генотипирования пчел, но и для исследования возможных мик- роэволюционных процессов в популяциях и изолятах пчел. Последнее обстоятельство представляется нам особенно интересным в части поисков экспериментальных подходов для исследования образования новых пород пчел или "размывания" чистоты породы и утраты ценных промышленных качеств в условиях неконтролируемой интродукции разных пород на территории Удмуртии.
Уместно отметить, что именно на пчелах с применением ПП ПЦР, похоже впервые, удалось получить полиморфные наборы как доминантных, так и кодоминантных генетических маркеров, позволяющих анализировать наследственные изменения. Скрининг препаратов геномной ДНК гаплоидного дрона и диплоидной пчеломатки с использованием 68 различных 10- нуклеотидных ПП дал суммарно 432 полосы на фингерпринтах: в среднем по 6,3 полосы и 1,3 полиморфизма на каждый праймер [5]. Для анализа наследования по такого рода маркерным аллелям были взяты 13 (из 68 ) праймеров. В результате были выявлены 4 типа полиморфизма:
- по присутствию или отсутствию полос;
- по яркости (интенсивности, пропорциональной количеству материала в полосе);
- по длине фрагментов (каждая полоса - это один класс фрагментов по размеру);
- по дцп- лоидспецифичным полосам, которые соответствуют гетеродуп- лексным продуктам, образующимся с ДНК альтернативных аллелей в гетерозиготах.
В двух из четырех случаев формирования гетеродуплексов альтернативные аллели проявляются как полиморфизм по размерам малых фрагментов. Обнаружение этого полиморфизма демонстрирует, что некоторая доля маркеров, генерируемых в ПП ПЦР, наследуется не по доминантному типу. Это существенно, поскольку полагают, что анализ именно кодоминантного наследования может быть информативным для выявления мутационных или адаптивных изменений у потомства.
Очень интересны результаты применения метода ПП ПЦР в исследованиях по генетике поведения и адаптации у пчел. В традиционных количественных моделях эволюционной генетики считается, что вариации адаптивных поведенческих характеристик и их наследование определяются множеством генов, каждый из которых обнаруживает очень малый аддитивный эффект [6]. Исследования на пчелах показали, что всего лишь два генетических локуса имеют определяющее значение Для реализации комплекса важных поведенческих характеристик пчел, влияющих на медосбор [4]. Ориентируясь на наличие или отсутствие этих локусов, выявляемых по набору полиморфных маркеров, генерируемых в ПП ПЦР, можно предсказать преимущественную ориентацию исследуемых пчел на сбор пыльцы или нектара, количественно оценить размер индивидуального взятка и общие запасы пыльцы в пчелиной колонии. Было также продемонстрировано, что наследование конкретными особями альтернативных аллелей локуса pln2 определяет концентрацию сахара в нектаре их, взятка.
Постановка задачи исследований пород пчел
Создание реестра генотипических паспортов пород пчел Удмуртии, применение которого позволит в дальнейшем с высокой точностью проводить определение пород пчел. Можно надеяться, что результаты работы в целом могут быть использованы в селекционной работе по восстановлению чистоты породы среднерусской медоносной пчелы. Генотипические паспорта можно также рассматривать как эталон здорового состояния пчел при проведении молекулярно-генетической диагностики в случае подозрения на инфекционные и паразитические заболевания пчел.
Отдельный интерес, на наш взгляд, представляет вопрос о возможности формирования репродуктивных изолятов пчелиных популяций на базе нескольких пород, длительно культивируемых в одной местности в условиях географической изолированности и отсутствия ввоза новых пчеломаток. Дрейф генов (за счет миграции самцов-оплодотворителей) и селекция по какому-то признаку (при участии природного фактора или факторов социальной иерархии у "общественных насекомых") могут быть причиной образования устойчивых генетических (репродуктивных) изолятов как предшественников новых пород или подвидов из нескольких пород, длительно культивированных в условиях, допускающих скрещивание. Такое возможное направление исследований более тяготеет к фундаментальным, но не лишено и прикладного интересу.
Плодотворным подходом для изучения организации генома пчел оказалась ПЦР, в частности ПП ПЦР. С помощью этого метода удалось построить стратегию создания генетической карты сцепления для пчел [3], разработать принципиально новые подходы исследования генетики поведения пчел [4], а также получить генопортреты отдельных особей пчел и подобрать генетические маркеры, выявляющие различные типы наследования [5].
Наша программа исследований основана на использовании метода ПП ПЦР. Геномную ДНК пчел (матрица для ПЦР) предполагается получать из грудного сегмента насекомых. Не исключено использование в качестве объекта и личинок пчел. Подготовка и хранение биопроб осуществляется по разработанной авторами методике. Фенотипические и отологические характеристики пчелиных семей, отобранных для генотипирования, будут унифицированы по общепринятым методам с указанием места сбора, пасеки и, по возможности, "родословной" роя.
Для проведения ПЦР нужны хорошо очищенные высококачественные реагенты, олигонуклеотидные праймеры и термостабильная ДНК-полимераза. Праймеры синтезируются по заказу в лабораториях, обладающих специальным оборудованием, по указанной заказчиком нуклеотидной последовательности. Специфическими, с высокой вероятностью могут оказаться праймеры для работы ДНК-полимеразы на разных матрицах ДНК. Есть основания полагать, что микросателлитные олиго- , нуклеотиды будут адекватными праймерами для решения поставленной задачи. Вероятно, придется на этапе отработки технологии подобрать оптимальные 2-3 праймера из некоторого набора, если поиск в международных компьютерных базах данных не обнаружит публикаций с конкретным указанием праймеров, успешно применявшихся ранее для генотипирования пчел, или близких таксономических единиц.
Наладочные эксперименты
Получение генопортретов. Мы провели серию наладочных экспериментов по выделению тотальных препаратов ДНК из отдельных особей пчел. Метод ПП ПЦР дает вполне приемлемые по воспроизводимости результаты как по весовому выходу ДНК, так и по степени ее очистки. Как отмечают сами авторы метода, после однократной экстракции фенолом и хлороформом в препаратах остается еще довольно много белка и, вероятно, остатков хитиновых оболочек. Для 10 полученных препаратов указанный выше коэффициент изменялся в пределах от 1,32 до 1,68 (для хорошо очищенных препаратов из клеток бактерий или животных величина эта составляет обычно 1,8-2,0). Однако, по опыту разработчиков метода, суммарные "ненуклеиновые" примеси не мешают проведению ПЦР и не искажают спектр получаемых продуктов. Единственным неудобством в этом отношении является проблема оценки концентрации водных растворов ДНК традиционным методом по величине оптической плотности при 260 нм.
За счет присутствия загрязнений ошибка измерений оказывается весьма высокой (завышенной) и соответственно количественные определения весьма приблизительными. В нашем случае (в серии из 10 независимых экстракций) выход ДНК, оцененный таким при близительным способом, составляет 1,5 - 2,7 мкг ДНК на каждую пчелу. Существенные колебания этой величины определяются, вероятно, разной степенью экстрагируемости нуклеиновых кислот из-за различной степени измельчения исходного материала ("заспиртованной" пчелы) в процессе гомогенизирования в каждом случае. Можно ожидать, что более стабильные результаты и более высокий выход ДНК будет достигнут, если хранение и измельчение пчелиных тушек для экстракции проводить в жидком азоте. Однако это менее выгодно и даже неудобно из практических соображений в случае сбора пчел в полевых условиях.
Что касается неточностей с определением концентрации ДНК, то проблема решается двумя способами. Во-первых, при необходимости можно провести определение концентрации ДНК в растворах, содержащих белковые и иные примеси, с применением методов, основанных на специфических реакциях. Например, дифениламиновьш реагент позволяет выявлять только ДНК даже в присутствии значительных количеств РНК или белка по специфической реакции с дезоксирибозой. Во-вторых, на этапе отладочных экспериментов в этом собственно не было необходимости. Более существенным представлялось подобрать оптимальное количество ДНК для проведения ПЦР. С этой целью мы вносили в реакционные смеси аликвоты изолированных из пчел препаратов ДНК с тем, чтобы количества матрицы ДНК отличались (пусть даже при неточном определении) как 5 нг, 50 нг и 100 нг.
Условия ПЦР и электрофореза продуктов ПЦР. Очень важным, или даже определяющим, моментом для получения набора дискретных полиморфных продуктов в ПЦР с произвольными праймерами на любой матрице ДНК, в том числе и на пчелиной, является удачный подбор праймеров. К примеру, в одной из своих работ с Apis mellifera Hunt & Page [5] в предварительных экспериментах тестировали 68 праймеров (10- нуклеотидных, синтезированных Орегон Technologies, Inc.) с тем, чтобы остановиться на использовании в основных экспериментах на 13 из них. Из имевшихся в лаборатории праймеров мы выбрали два, удачное применение которых было описано [7] в ПТ IP по протоколу "двойной строгости" (DS-PCR) на геномной ДНК плодовой мушки: (5' -даса-3') 4 и десятимерный олигонуклеотид (5'-ctcaccgtcc-3') , синтезированный по закону случайных событий.
Разработанный этими авторами вариант ПЦР можно рассматривать в качестве разновидности ПЦР с произвольными (или случайно выбранными) праймерами. Отличительной особенностью этого варианта является одновременное использование в ПЦР сразу двух неспецифических праймеров. Мы не стали отходить от стандартной схемы ПЦР с произвольными праймерами и попытались подобрать условия реакции для использования каждого из праймеров по отдельности.
ПЦР проводили в реакционной смеси объемом 25 мкл, включающей 670 мМ трис-НСl, 160 мМ (NH4)2Sd4,0,1% твин 20, 4 мМ MgC12 , по 200 мкМ каждого из четырех dNTP, 1 мкМ праймера и 0,75 ед Taq-полимеразы. С каждым из праймеров проводили реакцию в присутствии 5 нг, 50 нг или 100 нг ДНК (приблизительно!; см. выше). На реакционную смесь наносили по 35 мкл минерального масла. Температурные режимы выбрали, ориентируясь на состав праймеров. Для произвольного 10- нуклеотидного праймера: 94° С =1 мин; 35°С =1 мин; переход от 35°С к 72°С с инкрементом 0,3°С/ сек; 72°С - 2 мин. Для (даса) 4 праймера: 94°С =1 мин; 48°С =1 мин; переход от 35°С к 72°С с инкрементом 0,3°С/сек; 72°С = 2 мин. Количество циклов в обоих случаях - 45.
После окончания ПЦР третья часть водного объема реакционной смеси смешивалась с "утяжеляющим" окрашенным буфером и наносилась на 6%-й неденатурирующий ПААГ (15x15 см, толщина 0,9 мм). Разделение проводили в приборе для вертикального электрофореза в 1-кратном триацетатном буфере при напряжении на электродах 200 В в течение 2или 6 часов. Ток в этих условиях был в пределах от 50 мА до 70 мА. Далее гели фиксировались в 7%-й уксусной кислоте и проводилась окраска разделенных э/форезом продуктов ПЦР азотнокислым серебром строго по протоколу метода Caetano-Annolus & Gresshoff (1994).
Краткое описание результатов
Получены изображения гено- портретов пчел (породы не идентифицированы) с двумя описанными праймерами. Оказалось, что 10-мерный праймер не дает дискретного набора полос и по этой причине не представляет для нас интереса. Праймер (даса) 4 генерирует дискретный набор продуктов, которые могут быть разрешены по-разному, в зависимости от типа геля и условий фореза. После 2-часового фореза можно различить порядка 10 отдельных полос. Надеясь получить более детальное разрешение полос на геле, мы увеличили длительность электрофореза, не меняя остальных его условий. В варианте электрофоретического разделения в течение 6 часов (при описанных выше условиях) продуктов ПЦР с (даса) 4 праймером ожидаемого улучшения разделения не было достигнуто. В будущем есть смысл попробовать электрофорез этих продуктов в агарозном геле. Практически все продукты реакции представлены фрагментами выше 600 пар оснований, если ориентироваться на размеры маркерных фрагментов. Наиболее четкими выглядят полосы на дорожке, где были нанесены продукты ПЦР на 5 нг матрицы пчелиной ДНК (в сравнении с реакциями на 50 и 100 нг, хотя в последнем случае общее количество продукта явно больше). Это согласуется с рекомендациями некоторых авторов снижать количество матрицы в реакциях с произвольными праймерами при необходимости получить спектр дискретных продуктов ПЦР.
Таким образом, на сегодняшний день мы располагаем, по крайней мере, одним праймером, с которым есть смысл работать в дальнейшем. Пока трудно сказать, дает ли он полиморфные генетические маркеры, пригодные для генотипирования пород пчел. Этот ответ можно получить, поставив серийные исследования.
Заключение.
Анализ современной литературы по методам и стратегии молекулярно-генетических исследований на основе ПЦР позволяет сделать вывод о широких перспективах применения различных вариантов ПЦР как в фундаментальных, так и в прикладных исследованиях в сельскохозяйственной биологии. Приведенные в предшествующих разделах сведения об особенностях биологии пчел, а также вся совокупность информации по методическим подходам в молекулярной генетике пчел позволяет полагать, что ПЦР с произвольными праймерами является методом, адекватным решению поставленной задачи генотипирования пород пчел Удмуртии. Результаты предварительных экспериментов демонстрируют наличие отработанной технологической цепочки для проведения масштабных исследований в части молекулярно-генетических исследований.
В.Г. Безлепкин, М.ГЛомаева, Г.В. Васильева
Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, Пущино
Список литературы
- Ruttner F.: Biogeography and Taxonomy of Honeybees Berlin, 1988.
- Garnery L., Comuet J.-M., Solinac M. // Mol. Ecol. 1992 1.145-154.
- Hunt G.J., Page R.E.//Genetics. 1995. 139. 1371-1382.
- Hunt G.J. Page R.E., Jr., Fondrk M.K., Dullum C.J.// Genetics. 1995. 141. 1537-1545.
- Hunt G.J., Page R.E., Jr.//Theor. Appi. Genet. 1992. 85 15-20.
- Orr H.A., Coyne J.A. // Am. Nat. 1992. 140. 725-742.
- Matioli S.R., de Brito R.A. // BioTechnuiques. 1995 19 752-756.
